Proces proizvodnje elektroforeze u poliakrilamidnom gelu (PAGE) uglavnom uključuje korake kao što su priprema gela, rad elektroforeze, bojenje i posmatranje rezultata.
Priprema gela Priprema gela za separaciju (10%): Pomiješajte 0 ml ddH₂O, 3 mL 30% osnovnog gela, 5 mL 5 mol/L Tris-HCl, 1 mL 10% SDS i 1 mL 10% AP, a zatim dodajte TEM 4 na dnu, dodajte 10% AP μL TEMED-a i dobro promiješati. Sipajte ovu smjesu između staklenih ploča, zatvorite vrh vodom i pričekajte 30-60 minuta da se gel potpuno polimerizuje.
Priprema gela za slaganje (4%): Pomiješajte 4 ml ddH2O, 33 ml 30% osnovnog gela, 25 ml 1 mol/L Tris-HCl, 0,2 ml 10% SDS i 0,2 ml 10% AP, dodajte 2 μL TEMED-a i odmah dobro promiješajte. Izlijte vodu na gel za odvajanje, dodajte ovu smjesu i odmah umetnite češalj između staklenih ploča, čekajući 15-30 minuta da se gel za slaganje potpuno polimerizira.
Rad elektroforeze Tretiranje uzorkom: Pomiješajte uzorak sa jednakom količinom pufera za punjenje 2XSDS, zagrijavajte na 100 stepeni 3-5 minuta, a zatim centrifugirajte na 12.000 rpm 1 minutu, i uzmite supernatant za SDS-PAGE analizu.
Učitavanje: Uzmite 10 μL induciranih i neinduciranih uzoraka i dodajte ih u zbir uzoraka i dodajte 20 μL standarda proteina niske molekularne težine kao kontrolu.
Elektroforeza: Dodajte 1X pufer za elektroforezu u rezervoar za elektroforezu, povežite napajanje, održavajte napon gela za slaganje na 60V, a napon gela za odvajanje na 100V. Kada bromofenol plavo dostigne dno rezervoara za elektroforezu, zaustavite elektroforezu (oko 3 sata).
Bojenje i posmatranje rezultata
Bojenje: Uklonite gel sa staklene ploče i bojite ga Coomassie Brilliant Blue otopinom za bojenje 4 do 6 sati na sobnoj temperaturi. Odbojavanje: Stavite obojeni gel u rastvor za odbojavanje i odbojite ga nekoliko puta dok proteinska traka ne bude jasno vidljiva. Posmatranje rezultata: Nakon odbojavanja, gel se može fotografisati i sačuvati. Nakon što je korak odbojavanja završen, stavite gel ispod sistema za obradu slike za fotografisanje i sačuvajte rezultate na disketi.